Na+/H+ exchanger와 HCO-3 transporter에 의한 흰쥐 타액선 선세포내 pH 조절
MODULATION OF INTRACELLULAR pH BY Na+/H+ EXCHANGER AND HCO-3 TRANSPORTER IN SALIVARY ACINAR CELLS
박동범, 서정택, 김재관, 정재용,
소속 상세정보
박동범 ( ) - 연세대학교 치과대학 소아치과학교실
서정택 ( ) - 연세대학교 구강과학연구소
김재관 ( ) - 연세대학교 치과대학 소아치과학교실
정재용 ( ) - 연세대학교 치과대학 소아치과학교실
KMID : 0358919980250020352
Abstract
결론
타액선 선세포는 혈액으로부터 전해질과 물을 유입하여 도관으로 이동시키므로써 타액을
형성하는 외분비 기관이다. 타액의 형성과정에는 많은 이동 단백질과 효소들이 관여하며 따
라서 세포내 pH가 적절히 유지되어야만 한다. 다른 모든 고등동물의 세포와 마찬가지로 타
액선 선세포의 세포내 pH조절에 중요한 역할을 하는 장치로 changer가 있는데 이
exchanger는 무스카린성 수용체의 자극으로 타액 분비가 항진될 때 활성화되는 것으로 알
려져 있다. 따라서 본 연구의 첫 번째 목적은 무스카린성 수용체 자극으로
Na+/H+ exchanger가 얼마나 활성화되는지 알아보는 것이며 두
번째로 Na+/H+ exchanger외에도 세포내 pH 조절에 관여하고
타액내 HCO-3 이온농도를 높여 치아우식증 예방에 관여할 것
으로 생각되는 HCO-3 cotransporter의 유무를 확인하는 것이
다.
흰쥐 수컷의 악하선에서 선세포를 분리하여 세포내 pH를 측정하는데 사용하는 형광물질
인 2’, 7’ -bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein(BCECF)를 세포내 축적시킨 후
악하선 선세포를 perfusion chamber에 넣고 현미경 상에서 세포내 pH 변화를
spectrofluorometer를 사용하여 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. HCO-3/CO2pH unit 감소한 후 0.04±0.007 pH unit/min의 속도로 증가하였으며
Na+/H+ exchanger 봉쇄제인 1mM anforide와
HCO-3 trangporter 봉쇄제인 200 μM 4,4’
-diisothiocyanato-subene-2,2’-disulphonic acid (DIDS)를 투여한 경우 세포내 pH증가가
억제되어 pH 증가속도가 0.01±0.002pH unit/min이었다.
2. 관류액에 NH+4 이온의 첨가와 제거로 세포내 pH가 감소
하였는데 HCO-3가 포함되지 않은 용액을 관류했을 경우 1
mM amiloride에 의해 pH 증가가 거의 완벽하게 봉쇄되어 세포내 pH증가가 전적으로
Na+/H+ exchanger에 의함을 알 수 있었다.
3. 10 μM carbachol 투여로 세포내 pH 증가속도가 0.16±0.01 pH unit/min에 서 0.28±
0.03pH unit/ min으로 빨라졌다.
4. 10μM carbachol을 투여한 경우 1mM amiloride 의 첨가로 세포내 pH 감소속도가
0.06±0.008pHunit/min으로서 이는 carbachol투여 전의 0.03±0.004pH unit/min 보다 빨랐다.
5. 세포내 H+ 이온에 대한 완충능 (buffering capacity) β1은 세포내 pH가
7.2-7.4 일 때 14.31±1.82이었으며 세포내 pH가 낮아질수록 β1 값이 증가하였다.
6. 10 μM carbachol 투여로 Na+/H+ excharlger를 통한
H+ 이온의 유출속도가 carbachol투여 전 보다 크게 증가하여
Na+/H+ exchanger의 활성도가 carbachol 투여로 alkaline shift
되었음을 확인하였다.
7. 흰쥐 악하선 선세포에서 세포내 PH를 조절하는 장치로
HCO-3를 유입시키 는 이동단백질이 있음을 확인하였다.
이상의 실험결과로 미루어 보아 횐쥐 타액선 선세포에서 세포내 pH를 유지하는데 가장
중요한 역할을 하는 Na+/H+ exchanger가 무스카린성 수용체의
자극으로 타액분비가 항진될 때 그 활성이 크게 증가하여 세포내 pH가 7.25에서 3배 가량
활성도가 커짐을 알 수 있었다. 또한 세포내 pH조절에도 관여하며 타액내 pH를 유지시키는
데에도 중요한 역할을 하는 HCO-3 이온을 세포내로 유입시키
는 이동단백질이 있음을 확인하였으나 이 이동 단백질이 세포내 어떤 기전에 의해 조절되는
지는 앞으로 계속 연구해야할 과제로 생각한다.
#초록#
Intracellular pH (pHi) plays an important role in the regulation of cellular processes
by influencing the acitivity of various enzymes in cells. Therefore, almost every type of
mammalian cell possesses an ability to regulate its pHi. One of the most prominent
mechanisms in the regulation of pHi is Na+/H+ exchanger.
This exchanger has been known to be activated when cells are stimulated by the
binding of agonist to the muscarinic receptors. Therefore, the aims of this study were to
compare the rates of H+ extrusion through
Na+/H+ exchanger before and during muscarinic stimulation
and to investigate the possible existence of HCO-3
transporter which is responsible for the continuous supply of
HCO-3 ion to saliva.
Acinar cells were isolated from the rat mandibular salivary glands and loaded with
pH- sensitive fluoroprobe, 2′, 7′ -bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein(BCECF),
for 30min at room temperature.
Cells were attached onto the coverglass in the perfusion chamber and the chages in
pHi were measured on the iverted using spectrofluorometer.
1. By switching the perfusafe from HCO-3 free to
HCO-3 buffered solution, pHi decreased by 0.39±0.02 pH
units follows by a slow increase at an initial rate of 0.04±0.007 pH units/min. The rate
of pHi increase was reduced to 0.01±0.002 pH units/min by the simultaneous addition of
1 mM amiloride and 100μM DIDS.
2. An addition and removal of NH+4 caused a decrease in
pHi which was followed by an increase in pHi. The increase of pHi was almost
completely blocked by 1mM amiloride in HCO-3-free
perfusate which implied that the pHi increase was entired dependent on the activation of
Na+/H+ exchanger in HCO-3-free
condition.
3. An addition of 10μM carbachol increased the initial rate of pHi recovery from 0.16
±0.01pH units/min to 0.28±0.03pH units/min.
4. The initial rate of pHi decrease induced by 1mM amiloride was also increased by
the exposure of the acinar cells to 10μM carbachol (0.06±0.008pH unit/min) compared
with that obtained before carbachol stimulation (0.03±0.004pH unit/min)
5. The intracellular buffering capacity β1 was 14.31±1.82 at pHi 7.2-7.4 and β1
increased as pHi decreased.
6. The rate of H+ extrusion through Na+/H+
exchanger was greatly enhanced by the stimulation of the cells with 10μM carbachol
and there was an alkaline shift in the activity of the exchanger.
7. An intrusion mechanism of HCO-3 was identified in rat
mandibular salivary acinar cells. Taken all together, 1 observed 3-fold increase in
Na+/H+ exchanger by the stimulation of the acinar cells with
10μM carbachol at pH 7.25. In addition, I have found an additional mechanism for the
regulation of pHi which transported HCO-3 into the cells.
amiloride; cotransporter; DIDS; intracellular pH; HCO-3 BCECF; Na+/H+ exchanger; spectrofluorometer;
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